植物愈傷組織培養 |
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| 來源：未知 作者：admin 發布時間：2013-07-31 13:35 |
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一、原理 苗木網,999miaomu.com 培養基的種類、成份直接影響到培養材料的生長發育，故應根據培養植物的種類和部位，選擇適宜的培養基。培養基種類繁多，最基本、最常用的培養基為MS培養基（見表1）。 2. 培養基的配制 ① 先按表1配制MS培養基貯液，②再將貯液與其他成分按比例混合。③ 此外還需加入適量的蔗糖作為碳源，起支持作用的瓊脂粉，適量的生長調節劑等。④ 將上述培養基加熱溶解后，加蒸餾水使培養基達到終體積。⑤ 再用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl 調節培養基的pH值至最適。⑥ 分裝至三角燒瓶，封口膜封口，等待滅菌后使用。 3. 幾種誘導愈傷組織的培養基 胡蘿卜MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA 玫瑰葉盤，芽 MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA 煙草葉盤、葉柄 MS+0.1mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA 中國苗木網,999miaomu.com pH 5.8，蔗糖30%，瓊脂粉6.5g/L。 （二）滅菌 1．培養基及器具滅菌培養基、無菌水需要在高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌作用取決于溫度，常用的滅菌溫度為121℃，所需時間應隨要滅菌的液體的容積變化而變化（見表2）滅菌結束后待溫度下降到50℃以下，才能取出已滅菌的培養基。 可用同樣方法對器具同時進行滅菌，包括：培養皿、解剖刀、剪子、濾紙、鑷子、打孔器等。 2．工作環境滅菌 接種前1ｈ打開超凈工作臺和棚面的紫外燈照射40min。殺菌結束后，先關掉棚面的紫外燈，再打開風機，最后關掉超凈工作臺上的紫外燈。在接種后休息時，要先打開臺面的紫外燈，再關風機，最后打開棚面紫外燈。不能將風機與臺面上的紫外燈同時關閉或先關閉風機再開紫外燈。 3 . 植物材料的滅菌 植株各部分的表面攜帶著各種微生物，他們是植物組培的污染源，所以在接種培養前必須進行徹底的表面消毒；組織內部侵染的真菌或細菌很難消除，這些組織一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用無菌潔凈濾紙吸干水分。 999苗木網,www.cqhuayin.com 植物材料的滅菌需在超凈工作臺內進行，可選擇不同的滅菌劑進行植物組織表面消毒（見表3）。同時注意，表面消毒劑對植物組織也是有毒的。因此，應當選擇消毒劑的濃度和時間，盡量減少組織的死亡。滅菌后，需用無菌水反復沖洗，徹底洗去表面消毒劑。 如：胡蘿卜儲藏根消毒：將胡蘿卜用洗滌靈清洗，擦干，切段。進超凈工作臺后，先用75%酒精擦洗切段，擦干后，在2%次氯酸鈉中浸泡5秒鐘，用無菌水沖洗10 次，無菌濾紙吸干，用滅過菌的打孔器取材。準備工作就緒后，可以進行接種。 （三）接種 1. 進臺 工作人員進入接種室前，需要洗凈手和手腕。進入超凈工作臺內需用75%酒精紗布擦拭手、手腕，再擦培養基瓶和超凈工作臺。 2. 接種 (1) 剪、鑷消毒：接種前剪、鑷應插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精燈外焰上徹底灼燒，灼燒時應將剪口、鑷口張開，燒至剪、鑷上火焰熄滅為止，冷卻后方可進行接種。接種后仍需灼燒并插回75%酒精的磨口瓶待用。注意每次取出時剪口并攏，不可接觸磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下。 中國苗木網,www.cqhuayin.com (2) 插植外植體：左手拿三角瓶，解開封口膜，將三角瓶幾乎水平拿著，靠近酒精燈焰，將瓶口外部在酒精燈火焰上燎數秒鐘，使瓶口的水氣散發掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒過的鑷子夾一塊外植體送入瓶內輕輕的插入培養基上，鑷子灼燒后放回磨口瓶，再把封口膜在酒精燈火焰上燎數秒，灼燎時應旋轉，避免燒壞，蓋好封口膜，扎緊皮筋，便完成了第一瓶的操作，接著再做第二瓶，如此直到外植體全部接完。 3 注意事項 (1) 操作人員的頭、胳膊等不得進入臺內； (2) 操作人員不得隨意談話、說笑，以免造成污染； (3) 用酒精對雙手消毒時，務必待酒精徹底揮發后再靠近酒精燈火焰，以免火焰傷手； (4) 臺外人員走動要輕、動作要小。 （四） 培養 接種或繼代培養的植物組織置于人工氣候箱中培養，溫度25±2℃，適當光照強度和光周期。每4-6周繼代一次。培養過程如果有的培養物被微生物污染，應當馬上將其清理，以免影響其它培養物。 （記者 佚名） 999中國苗木網,999miaomu.com |
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