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藍(lán)莓組培技術(shù)

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來(lái)源: 作者: 發(fā)布時(shí)間:2013-07-23 17:14

  一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)
  1.洗滌室:器具的洗滌、干燥
  2.配置室:進(jìn)行藥品的保存、配置、消毒、分裝等。
  3.滅菌室:對(duì)培養(yǎng)進(jìn)行高溫高壓滅菌,有時(shí)候也會(huì)把培養(yǎng)基的熬制、分裝放在此房間。
  4.接種室:進(jìn)行材料的接種,內(nèi)置超凈工作臺(tái)或接種箱。外設(shè)緩沖間-放置拖鞋、工作服、工作帽等。
  5.培養(yǎng)室:植物材料的無(wú)菌培養(yǎng),室內(nèi)主要有培養(yǎng)架和控制溫度及光照的設(shè)備。
  其他配套:大型組培室,包括工廠化組培車(chē)間還好專(zhuān)門(mén)配套倉(cāng)庫(kù)、更衣室和辦公室等,有的還要配備細(xì)胞學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行培養(yǎng)材料的組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、觀察照相等。
  二、常用設(shè)備和器材
  1.高壓蒸氣滅菌鍋:用于培養(yǎng)基、蒸餾水和接種器械的滅菌消毒。
  2.超菌工作臺(tái):用于培養(yǎng)物的無(wú)菌操作。(由鼓風(fēng)機(jī)、濾板、操作臺(tái)、紫外燈和照明燈組成)
  3.接種工具:包括鑷子、剪刀、解剖刀、灑精燈、接種器械滅菌器等。
  4.培養(yǎng)設(shè)備:包括空調(diào)機(jī)、定時(shí)器、溫度控制器、增濕機(jī)或去濕機(jī)、培養(yǎng)架、光照培養(yǎng)箱等。
  5.配置設(shè)備:包括天平、酸度計(jì)、磁力攪拌器、蒸餾水器、烘箱或玻璃儀器烘干器、電爐、藥品柜、冰箱或冷柜、晾瓶架等。
  在這些儀器設(shè)備中,高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、電子天秤、培養(yǎng)架、冰箱、接種工具等是組培必備的,也是每天都要用到的,因此質(zhì)量要可靠。 999苗木網(wǎng),www.cqhuayin.com
  三、玻璃器皿的選擇和清洗
  1.玻璃器皿的選擇
  *試管-適合于用少量培養(yǎng)基及試驗(yàn)各種不同配方時(shí)選用。
  *三角錐瓶-適用于各種培養(yǎng)(如固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、大規(guī)模培養(yǎng)或一般培養(yǎng))。
  *L形管和T形管-為專(zhuān)用的旋轉(zhuǎn)式液體培養(yǎng)試管。
  *培養(yǎng)皿-適于作單細(xì)胞的固體平板培養(yǎng)、胚和花藥培養(yǎng)和無(wú)菌發(fā)芽。
  *角形培養(yǎng)瓶和圓形培養(yǎng)瓶-適用于液體培養(yǎng)用,如單細(xì)胞和原生質(zhì)體的淺層培養(yǎng)。
  *組培瓶/果醬瓶-常用作試管苗大量繁殖用的培養(yǎng)瓶。
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  2.玻璃器皿的清洗
  (1)清洗玻璃器皿用的洗滌劑有肥皂、洗潔精、洗衣粉、和鉻酸鉀洗滌液。
  (2)清洗時(shí)先將器皿中的殘?jiān)ィ们逅磧簦儆脽岬姆试硭蛳礉嵕磧簦逅疀_洗干凈后用蒸餾水沖洗一次,干后備用。
  (3)洗凈的玻璃器皿應(yīng)透明發(fā)亮、內(nèi)外壁水膜均勻,不掛水珠。
  四、影響藍(lán)莓組培的因素
  1.樹(shù)種因素:(1)基因型,(2)植株年齡,(3)組織和器官的年齡,(4)植株的生理狀態(tài),(5)取材年份及生長(zhǎng)條件,(6)取材部位及大小。
  2.培養(yǎng)基因素:無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)化合物、植物激素、天然提取物、瓊脂、PH值、滲透壓、活性炭。藍(lán)莓組織培養(yǎng)的成功與否,除了培養(yǎng)材料本身的因素外,很大程度上取決于對(duì)培養(yǎng)基的選擇。培養(yǎng)基的種類(lèi)、成份等直接影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)發(fā)育。故應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料的種類(lèi)和部位,選取適宜的培養(yǎng)基。

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  3.外植體的選擇和滅菌:不同品種、不同器官之間的分化能力有差別,且組織培養(yǎng)是建立在無(wú)菌操作基礎(chǔ)之上的專(zhuān)門(mén)技術(shù),因此在進(jìn)行藍(lán)莓組織培養(yǎng)時(shí),必須選擇合適的外植體進(jìn)行滅菌操作,以確保組織培養(yǎng)工作的順利進(jìn)行。
  4.環(huán)境因素:(1)光照:包括光強(qiáng)、光質(zhì)、光周期,(2)溫度,(3)濕度,(4)氣體。
  五、藍(lán)莓培養(yǎng)基的主要成分
  (一)、基本培養(yǎng)基的主要成分:
  1.無(wú)機(jī)鹽:(1)大量元素:C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl。(2)微量元素:Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na。(3)水:培養(yǎng)基95%是水,應(yīng)使用蒸餾水、雙蒸水或使用去離子水,水應(yīng)放在塑料容器中。
  2.有機(jī)化合物:(1)糖(碳源和能源),(2)維生素類(lèi):有維生素b1(鹽酸硫胺素)、維生素b6(鹽酸砒哆醇)、生物素、煙酸、葉酸等,(3)氨基酸類(lèi)(有機(jī)氮源)。
  3.植物激素(生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)):
  (1)生長(zhǎng)素:主要包括IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、IBA(吲哚丁酸);它們的主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根,更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生;作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?,4-D>NAA>IBA>IAA。
  (2)細(xì)胞分裂素:天然:6-BA(6-芐基酰嘌呤)、KT(激動(dòng)素,糠基酰嘌呤);人工:ZT(玉米素)、2-iP(2-異戊烯酰嘌呤);它們的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)側(cè)芽的生長(zhǎng)及顯著改變其他的激素作用;作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篢DZ,4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT。

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  (3)赤霉素:GA3。
  (4)乙烯及乙烯抑制劑。
  4.天然提取物(如椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥等),其作用是提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等。
  5.瓊脂(是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物),其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固,同時(shí)不參與代謝。
  6.活性炭:加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力,減少一些有害物質(zhì)的影響,如可以防止酚類(lèi)物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。
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  (二)、藍(lán)莓培養(yǎng)基:上面提到這些物質(zhì)是組培過(guò)程經(jīng)常用到,具體到藍(lán)莓,一般用WPM培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,激素多用KT、6-BA,天然提取物和活性炭一般不用。
  六、藍(lán)莓外植體的選擇和滅菌
  (一)、外植體的選擇:以春季初發(fā)的嫩梢最為合適,取材時(shí)間要在晴天下午取材,取材部位以靠近木本的下部?jī)?nèi)堂枝為好。
  (二)、外植體的滅菌方法
  1、常用滅菌藥劑的使用和效果:
  消毒劑使用濃度/%清除難易消毒時(shí)間/min滅菌效果
  次氯酸鈉2易5-30很好
  次氯酸鈣9-10易5-30很好
  漂白粉飽和溶液易5-30很好
  升汞0.1-1較難2-10最好
  酒精70-75易0.2-2好
  過(guò)氧化氫10-12最易5-15好 999中國(guó)苗木網(wǎng),www.cqhuayin.com
  溴水1-2易2-10很好
  硝酸銀1較難5-30好
  抗菌素4-50mg/L中30-60較好
  對(duì)于藍(lán)莓而言,一般先用75%酒精處理10-30苗,再用升汞處理5-10分鐘,根據(jù)材料的老嫩程度、外界環(huán)境不同而選擇適當(dāng)?shù)奶幚頃r(shí)間,一般是從低到高作實(shí)驗(yàn)摸索最佳的處理時(shí)間。
  2.滅菌方法:
  (1)莖尖、莖段及葉片等的消毒:用清潔劑清洗、水流沖刷4小時(shí)左右---75%酒精浸泡10-30秒---無(wú)菌水洗1-2次---升汞溶液泡5-10min---無(wú)菌水洗7-10次
  七、外植體接種和培養(yǎng)
  1.外植體的接種
  (1)接種室的消毒:用70%酒精噴霧使細(xì)菌和真菌孢子隨灰塵的沉降而沉降,再用紫外燈照射20min;并且每月用高錳酸鉀與甲醛蒸氣熏蒸一次。超凈工作臺(tái)可用新吉爾滅或酒精擦洗,其它一切器皿、衣物都要經(jīng)嚴(yán)格的滅菌才能帶進(jìn)接種室。
  (2)接種:左手拿培養(yǎng)瓶,右手拿接種工具接種,瓶口要靠近酒精燈火焰、接種動(dòng)作要快,以免造成污染。
  2.培養(yǎng)方法
  (1)根據(jù)外植體不同可分為:胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)。藍(lán)莓常用的是器官培養(yǎng)或組織培養(yǎng)。
  (2)根據(jù)培養(yǎng)方式不同可分為:固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)。具體到藍(lán)莓,一般都是固體培養(yǎng),即用瓊脂作為支持物,在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)藍(lán)莓組培苗。

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  3.培養(yǎng)條件:指溫度、濕度、光照、PH值、氧和其它氣體等。藍(lán)莓一般在25度左右進(jìn)行光照培養(yǎng),光強(qiáng)一般為3000-5000Lux,培養(yǎng)間濕度不宜過(guò)高,要控制是60%以下。經(jīng)過(guò)三十多天的培養(yǎng),就可進(jìn)行分苗了。
  八、組培苗生根和馴化
  增值的藍(lán)莓苗達(dá)到所需的規(guī)模后,即可進(jìn)行生根處理了。藍(lán)莓一般采取瓶外生根技術(shù),即在溫室內(nèi)進(jìn)行扦插生根,此種方法可以大量節(jié)省組培室的投資規(guī)模和生產(chǎn)成本。
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