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葡萄卷葉病毒病研究發展

來源：作者：發布時間：2013-07-23 16:23

葡萄卷葉病毒病分布廣﹑危害大，在北京﹑河北﹑天津﹑山東及寧夏地區均有發生，在釀酒葡萄上表現尤其嚴重，染病植株果實的品質和產量都明顯降低，直接影響到葡萄酒的質量。現寧夏地區，在優良釀酒葡萄品種“蛇龍珠”上發現有嚴重的卷葉病毒病，導致果實的含糖量明顯下降，含酸量則上升。

1 病狀﹑傳播方式﹑發病和經濟危害

1.1 癥狀
　　葡萄卷葉病具有半潛隱性，在大部分生長季節不表現癥狀，多數歐亞種病株在果實成熟階段表現癥狀，在采收到落葉前葉片癥狀最明顯。其癥狀因品種﹑時間﹑環境條件及年份而不同。典型的特征是先從基部葉片開始，葉緣向下反卷，并逐漸向其它葉子擴展。通常，反卷的葉片變的紙脆，葉脈間出現壞死斑或葉片干枯。紅色品種在秋季前葉片先變成淡紅色，隨著秋季深入，病葉呈暗紅色，僅葉脈呈綠色[1-3]；白色品種葉片卷縮而不變紅，但是葉脈間稍有褪綠，病株果穗變小，果粒顏色變黃變暗，含糖量降低，成熟晚，病株葉片部位的鉀鎂鈣含量低于健康葉，而葉柄部位的含量較高。該病毒發生在果蒂穗梗﹑枝條和葉柄的韌皮部，葉子薄壁細胞和半胞的篩管發生堵塞和壞死。

1.2 傳播方式
    葡萄卷葉病主要是通過枝芽無性繁殖和帶毒砧木嫁接進行傳播，除GLRaV-3外，其它都沒有自然傳播介體。目前認為有5種粉蚧可以傳播GLRaV-3，分別是榕臀紋粉蚧（planococcusficus）﹑桔臀紋粉蚧（P.citri）﹑擬長尾粉蚧（pseudococcusaffinis）﹑柑橘棲粉蚧（P.calceolariae）和長尾粉蚧（P.longispinus）。另外，棉蚧（PulvinariavitisL）也可能是它的一個介體。Calbalaleiro通過ELISA研究粉蚧（Planococuscitri）傳播GLRaV-3的特點，結果表明：經帶毒粉蚧傳染后，僅在1/10的植株中檢測到GLRaV-3,80%以上的粉蚧在傳毒后1h內失去傳毒能力，而在新感病的葡萄植株中病毒具有潛隱性，至少在13個月內ELISA檢測不到。Pe.tersen和Charles用擬長尾粉蚧和柑橘棲粉蚧的第1和第3齡做傳毒實驗，結果表明這2種粉蚧只有第1齡可以傳毒。另外，Belli報道樺樹棉蚧可以傳播GLRaV-3。Habili等通過狹線印跡雜交和ELISA檢測，分析了葡萄品種黑品諾在行內相鄰葡萄間的自然傳毒特點，推測GLRaV-3可能靠移動很慢的介體傳毒[2-3]。 999苗木網,999miaomu.com

1.3 發病情況
    葡萄卷葉病分布極廣，凡有葡萄栽培的地區都有卷葉病毒病的存在。在遼寧興城﹑山東青島﹑天津﹑寧夏等葡萄產區均有發生[4-5]。寧夏玉泉營地區葡萄圃內的50多個品種和砧木的卷葉病自然發病情況的調查研究表明：在美洲種群﹑東亞種群中沒有發現卷葉病癥狀，歐亞種群卷葉病癥狀的品種比例最高，且程度嚴重；歐美雜種﹑歐山雜種均有表現卷葉病毒的品種，但發病率﹑嚴重程度低于歐亞種；歐亞種中，以鮮食品種為主的東方品種群比以釀酒品種為主的西歐和黑海品種群卷葉病發病率低；其中，在釀酒葡萄品種中卷葉病最嚴重的品種有：白詩南﹑品麗珠﹑梅鹿輒﹑蛇龍珠﹑白玉霓﹑赤霞珠﹑哥海娜﹑黑比諾[5]。

1.4 經濟危害
    葡萄感染卷葉病以后，其葉片中的葉綠素含量﹑光合速率都明顯低于健康品種，導致后期經濟產量的降低，株產量比對照減少近4倍左右，同時病株漿果含糖量偏低，而酸度上升，直接影響了釀酒葡萄的品質。其中釀酒葡萄品種“蛇龍珠”的病株與正常植株相比，結果枝數﹑結果系數﹑果穗數﹑穗重﹑單果粒重和株產都明顯降低，還原糖含量低10g/L左右，總酸含量則高3g/L左右[6]。

2 病原
    葡萄卷葉病毒屬是從原有的長線病毒屬中分離出的一個植物病毒屬，2002年7月由ICTV核準。本屬病毒粒子長度大于1000nm，通常為1400~2200nm。包含一個線狀﹑正單鏈RNA分子，大小為16.9~19.5kb。其CP（外殼蛋白）亞基的分子量大，為35~39kDa。葡萄卷葉病相關病毒GLRaV-3為本屬的典型種，基因組大小為16.9~19.5kb,CP(外殼蛋白)大小為35~37kDa,CPd通常定位在CP基因的下游，由偽介殼蟲和粉蚧傳毒[7]。

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    自20世紀80年代首次報道葡萄卷葉相關病毒GLRaV-1以來，至少已確立了9種名命為葡萄卷葉相關病毒的病毒病（GLRaV-1到GLRaV-9）。GLRaV-9是2002年在美國加利福尼亞首次報道[7]，隨后在澳大利亞的部分葡萄品種上也觀察到。

3 檢測技術
    目前葡萄病毒的檢測使用最廣泛的是指示植物法和血清學方法，分子生物學檢測（PCR檢測技術）已有報道，但還未應用于生產中的大批量檢測。葡萄卷葉病毒沒有草本寄主，只有木本寄主植物，檢測所需的時間長[3，7]。

3.1 血清學檢測
    ELISA檢測在葡萄卷葉病毒上應用較普遍，但是測試的陰性不能作出無病毒的結論，仍需要指示植物嫁接鑒定后才能確定。目前，ELISA可檢測出葡萄衰退病﹑GLRaV-1到GLRaV-8﹑GVA﹑GVB﹑GVC﹑GVD和GRSPaV。我國蔡文啟等采用幾種間接異種動物抗體雙夾心法和PAS-ELISA，成功地從葡萄園感病植株及組培苗木中測定了GLRaVs[8]。單克隆抗體大大提高了ELISA的可靠性，已制成了GFKV﹑GLRaV-1﹑GLRaV-2﹑GLRaV-6﹑GLRaV-8和GVD的單克隆抗體和GRSPaV的多克隆抗體。對同一種病毒能用PCR-ELISA檢測，不僅能增加檢測的靈敏度，而且還能降低檢測成本。在商品試劑盒中，陽性對照材料是用感病植物材料制成的，存在著植物健康方面的風險，用克隆抗原會克服這些問題[9]。 999中國苗木網,www.cqhuayin.com
    葡萄卷葉病血清學檢測的方法有DAS-ELISA（抗夾心-ELISA）﹑PTA-ELISA（間接-ELISA）和PAS-ELISA（A蛋白夾心-ELISA）檢測。DAS-ELISA能縮短檢測時間，提高工作效率，特別是檢測大量樣品時優勢更大，然而這項技術具有較高的株系特異性，在檢測中可能產生假陰性反應，必要時可以用PTA-ELISA和PAS-ELISA對一些關鍵樣品進行復檢[10]。用DAS-ELISA檢測葡葉病毒病，植株下部幼嫩組織是最適的檢測部位[11]。PAS-ELISA(A蛋白夾心-ELISA)檢測在脫毒組培苗檢測中有應用[10]。

3.2分子生物學檢測
    聚合酶鏈式反應（Polymeras china reaction,PCR），即無細胞克隆，是美國Cetus公司人類遺傳學研究室科學家Kary B.Mulli在1985年發明的一種快速的特定DNA片段體外擴增法。
    葡萄卷葉病的檢測是提取材料中的總RNA或dsRNA，經反轉錄獲得cDNA來作為模板進行特定DNA片段體外擴增，再進行瓊脂糖凝膠電泳。國際上RT-PCR成功的應用于GLRaV-1﹑GLRaV-2﹑GLRav-3﹑GLRaV-4﹑GLRaV-5﹑GLRaV-6﹑GLRaV-7檢測；分子雜交以應用于GLRaV-1﹑GLRaV-2﹑GLRaV-3[7]。
    國內有關葡萄卷葉病毒IC-RT-PCR和RT-PCR檢測已有報道。有報道RT-PCR擴增的片段序列與病毒源序列的同源性高達99.3%，說明RT-PCR法檢測葡萄卷葉病毒GLRaV-3結果可靠[12]，但該技術存在提取總RNA（其他物質影響）和dsRNA（含量少）困難，牛建新[13]等對RNA和dsRNA的提取方法進行了研究，篩選出了適合的方法。陳建軍[14]等對DAS-ELISA﹑RT-PCR和IC-RT-PCR檢測葡萄卷葉病毒GLRaV-3的效果進行比較研究表明： RT-PCR在GLRaV-3的檢測中不穩定，受到環境﹑實驗儀器﹑實驗員身上的RNA酶的影響，以及植物組織中其他植物（蛋白質﹑DNA﹑多糖等）等污染，提取完整純化的RNA非常困難，增加了實驗難度，并且直接影響了檢測結果；而IC-RT-PCR不用提取RNA，彌補了RT-PCR的不足，使得檢測更為簡便﹑快速。但對于病毒含量低的樣品的檢測，RT-PCR是一種比較好的檢測方法，其靈敏性隨著病毒含量的增加而增加。不論帶癥狀與不帶癥狀的品種，選用韌皮部作為實驗材料，3種方法均可檢測出GLRaV-3。對葉片的檢測結果則不一，對于帶癥的品種，RT-PCR和IC-RT-PCR對上﹑中﹑下部的葉片都檢測到了病毒。對于不帶癥的品種，中部葉片，秋季IC-RT-PCR的檢出率為100%。牛建新[13-15]等在GLRaV-3的RT-PCR的有效體系的基礎上，通過對RT-PCR主要成分對RT-PCR的影響，確立了葡萄卷葉病毒的RT-PCR的優化體系和多重RT-PCR檢測優化體系，用于同時檢測GFLV和GLRaV-3。 999苗木網,999miaomu.com

4 脫毒技術

4.1 葡萄卷葉病毒病脫出的方法
　　微莖尖培養﹑微莖尖結合藥劑處理﹑微莖尖結合熱處理（盆栽原材料熱處理和試管苗熱處理）3種方法在脫出葡萄卷葉病毒上都有應用，目前微莖尖結合熱處理（試管苗熱處理）效果較好。顧沛雯[16]等實驗表明微莖尖結合熱處理（試管苗熱處理）的脫毒率和成活率都高于微莖尖培養﹑微莖尖結合藥劑處理﹑微莖尖結合熱處理（原材料熱處理），即保證了脫毒率又保證了成活率。微莖尖結合熱處理（盆栽原材料熱處理），變溫處理比恒溫處理脫毒率相差不大，但成活率要明顯提高。

4.2 基因轉導
　　歐洲國家（如奧地利﹑法國﹑意大利﹑瑞士），以色列及美國首先注意到一些葡萄病毒病毒是通過線蟲和粉蚧傳染的，已將GLRaV-2和GLRaV-3外殼蛋白基因導入到沙地葡萄品種和其它砧木中。通過轉基因進行遺傳轉化，獲得了對病毒產生抗性的植株，目前仍在試驗階段。

（摘自《中外葡萄與葡萄酒》）      （寧夏大學葡萄工程技術研究中心，銀川 750021）作者：李玉霞，王振平，奚強

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